اثر غلظت‌ نمک‌های‌ معدنی‌ MS، ساکارز و بنزیل‌ آدنین‌ بر پرآوری‌ ریز‌نمونه‌ های‌

متفکر

سرخس‌ بوستونی‌

(Nephrolepis exaltata Schott cv. Bostoniensis)

** مرضیه‌ شفیعی‌ حاجی‌آباد1، یوسف‌ حمید‌اوغلی2، جواد فتاحی‌ مقدم3

1- دانشجوی‌ فارغ التحصیل کارشناسی‌ ارشد باغبانی‌ دانشگاه گیلان2- استادیار گروه علوم‌ باغبانی‌ دانشگاه گیلان. 3- کارشناس‌ ارشد موسسه‌ تحقیقات‌ مرکبات‌ کشور‌، رامسر.

چکیـدهدلقک

سرخس‌ بوستونی (Nephrolepis exaltata Schott cv. Bostoniensis) یکی از‌ زیباترین‌ گیاهان‌ آپارتمانی‌ است. این تحقیق‌ به منظور‌ دست‌یابی‌ به روشی‌ مناسب‌ جهت تکثیر‌ انبوه‌ این گیاه‌ صورت گرفت.‌ برای انجام این‌ تحقیق‌ از ریز‌نمونه‌های‌ شاخساره‌ درون شیشه‌ای‌ به طول‌ 3 تا mm7 استفاده‌ شد. شاخساره‌ها در 12 محیط‌ کشت‌ مختلف، دارای دو‌ غلظت‌ نمک‌های‌ معدنی‌ (2/1 و 4/1 غلظت‌ نمک‌‌های‌ MS)، دو غلظت‌ ساکارز‌ ( 20 و g/l 30‌) و سه غلظت‌ بنزیل‌ آدنین (5/0، 1 و mg/l 2)، کشت شدند‌ بعداز مدت‌ 6 هفته‌ تعداد شاخساره‌، طول‌ شاخساره‌، وزن‌تر‌ و وزن‌ خشک اندام‌های‌ هوایی‌ اندازه‌گیری‌ شدند. تولید‌ اجسام سبز‌ کروی‌ نیز در محیط‌های‌ مختلف مورد‌ بررسی قرار‌ گرفته و برای‌ تعیین‌ ماهیتشان‌ از آنها‌ برش‌های‌ میکروسکوپی‌ تهیه شد.‌ بیشترین‌ تعداد شاخساره‌ در محیط‌ کشت‌‌های دارای‌ MS 2/1، g/l 30‌ ساکارز، 2و1 mg/l بنزیل‌ آدنین‌ ( به ترتیب‌5/0  25 و 5/0 21 عدد با طول‌ 5/0 5 و 5/0 6 mm) بدست آمد لذا این دو محیط‌ به عنوان‌ مناسب‌ترین‌ محیط‌ها‌ جهت پرآوری‌ سرخس‌ بوستونی‌ معرفی‌ شدند.

کلمات کلیدی : سرخس‌ بوستونی ، پرآوری، نمک‌های معدنی، ساکارز، بنزیل‌ آدنین، اجسام‌ سبز‌‌کروی

مقدمـهخواب

سرخس‌ بوستونی (Nephrolepis exaltata Schott cv. Bostoniensis) رایج‌‌ترین‌ و محبو‌‌ب‌ترین‌ کولتیوار‌
نفرولپیس است ( 12و 13) در دهه‌های اخیر تولید‌ انبوه این گیاه از طریق کشت‌ درون شیشه‌ای‌
[1] ( کشت‌ بافت گیاهی) متداول‌ شده است
(9، 12و 13) فرآیند‌ باز‌زایی‌ اسپروفیت‌ سرخس‌ از طریق باززایی مستقیم‌ و یا باز‌زایی‌ غیر مستقیم‌ از کالوس‌ و یا مرحله‌ اسپور‌زایی گامتوفیت است‌
(16 و 17)، عوامل‌ زیادی‌ مثل سن‌‌ ریز‌نمونه‌، باز‌جوانی، مقدار‌ مواد‌غذایی، ترکیب‌ و غلظت‌ تنظیم‌کننده‌های رشد، روش‌‌کشت‌ جامد یا مایع، مسیرهایی‌ باز‌زایی را که سلول‌های‌ اسپروفیت‌ در پیش‌ می‌گیرند‌ کنترل‌ می‌کند (16).

در پژوهشی که توسط پاسکوال و هوشیگا[2] (1994) بر روی غلظت‌های مختلف نمک‌های MS (. ، 25 ، 50 ، 75 و 100 درصد) به همراه 5 غلظت ساکارز ( . ، 15 ، 30‌ ، 45 ، 100 گرم بر لیتر) صورت گرفت از ریزنمونه‌های شاخساره درون شیشه‌ای استفاده کردند. آنها محیط کشت دارای یک چهارم غلظت نمک‌های MS و 30 گرم در لیتر ساکارز را با تولید 6/2 شاخساره جدید از هر شاخساره را به عنوان بهترین محیط پرآوری معرفی کردند (15). گومارز و همکاران[3] (1999) در پژوهشی دیگر در مورد ریزازدیادی سرخس بوستونی غلظت‌های مختلف نیتروژن معدنی (0 ، 25 ، 50 ، 100 . 200 درصد) در تقابل با 6 غلظت مختلف ساکارز (. ، 5/7 ، 15 ، 30 ، 60 و 120 گرم بر لیتر) را بررسی کرده و 25 درصد نیتروژن به همراه 5/7 گرم بر لیتر ساکارز را برای ریزازدیادی سرخس بوستونی توصیه کردند (8). زیو[4] (2000) در کشت مایع ریزنمونه‌های سرخس در بیوراکتور نصف غلظت نمک‌های MS و 30 گرم در لیتر ساکارز را برای ریزازدیادی سرخس بوستونی پیشنهاد کرد 017). نکته قابل توجه در پرآوری سرخس بوستونی تولید ساختارهایی کروی به نام اجسام سبز کروی[5] است. وقتی تنظیم‌کننده‌های رشد با یک نسبت مشخص به محیط افزوده شوند ظاهراً به عنوان یک محرک مورفولوژیکی عمل کرده و نمو مریستم‌های کروی[6] و جوانه‌های خوشه‌ای[7] را سبب می‌شوند (4 و 17). ریزازدیادی سرخس با استفاده از اجسام کروی سبز اولین بار توسط هیگوچی و همکاران (1987) در مورد نفرولپیس کوردیفولیا گزارش شده است. وی با استفاده از این روش در طول شش ماه از یک نوک رانر 16000 گیاهچه تولید کرد (11). هیگوچی و آماکی (1989) در تحقیقی دیگر تولید اجسام کروی سبز را از ریزنمونه‌های ریزوم سرخس آسپلنیوم نیدوس[8] در محیط حاوی 2/2 میکرومول بر لیتر BA گزارش کردند (10). برترند و همکاران[9] (1999) نیز سرخس پولی پودیم کامبریکوم[10] را با استفاده از تولید اجسام کروی سبز در حضور هورمون BA تکثیر کردند (4).

با توجه به اهمیت مرحله پرآوری و تولید اجسام سبز کروی در ریزازدیادی و تولید انبوه سرخس بوستونی این تحقیق به منظور بدست آوردن مناسب‌ترین محیط کشت برای تکثیر سریع و انبوه سرخس بوستونی صورت گرفته است و بهترین ترکیب محیط کشت‌ها برای پرآوری سرخس بوستونی معرفی شده‌اند.

مواد و روش‌ها

برای ارزیابی اثر محیط‌های مختلف بر مرحله پرآوری سرخس بوستونی 12 محیط مختلف، دارای 2 غلظت نمک‌های MS (14) (2/1 نمک‌های MS و 4/1 نمک‌های MS)، 2 غلظت ساکارز (20 و 30 گرم در لیتر) و 3 غلظت هورمون BA (5/0 ، 1 ، 2 میلی‌گرم در لیتر) تهیه شده و در شیشه‌های کشت (مربا) به مقدار 70ـ50 گرم در لیتر و در سه تکرار توزیع شدند (جدول1). محیط‌ها با 8 گرم در لیتر آگار به حالت جامد در آمدند و pH محیط قبل از اتوکلاو در 7/5 ثابت گردید. در این آزمایش از شاخساره‌های درون شیشه‌ای سرخس بوستونی به طول 7ـ3 میلی‌متر که در محیط کشت حاوی نصب غلظت نمک‌های MS به همراه 20 گرم در لیتر ساکارز و یک میلی‌گرم در لیتر هورمون BA کشت شده بودند، استفاده شد. ریزنمونه‌ها به تعداد سه شاخساره در هر شیشه کشت شدند. شیشه‌های کشت که ریزنمونه‌ها در آنها کشت شده بودند در اتاقک رشد دارای 2000 لوکس نور و در دمای 27 درجه سانتی‌گراد با طول روز 16 ساعت روشنایی نگهداری شدند. پس از شش هفته به منظور خنثی کردن اثرات احتمالی باقیمانده از محیط کشت قبلی یکبار بازکشت در تمامی محیط‌ها صورت گرفت. بعد از گذشت شش هفته، گیاهچه‌ها از شیشه‌ها خارج و صفاتی چون تعداد شاخساره، طول شاخساره، وزن تر و وزن خشک قسمت‌های هوایی به همراه وجود اجسام سبز کروی مورد ارزیای قرار گرفت. برای تعیین ماهیت اجسام سبز کروی از آنها برش‌های میکروسکوپی تهیه شد. این آزمون به صورت فاکتوریل و در پایه طرح کاملاً تصادفی در 3 تکرار انجام شد. آنالیز داده‌ها با نرم‌افزار MSTATC و مقایسه میانگین‌ها با آزمون چند دامنه‌ای دانکن در سطح احتمال 5 درصد بر روی داده‌های اصلی انجام شد. رسم نمودارها با نرم‌افزار EXCEL صورت گرفت.

نتایج و بحث

اثر ساده غلظت نمک‌های معدنی بر صفات اندازه‌گیری شده

نتایج حاصل از جدول تجزیه واریانس نشان داد که اثر غلظت نمک‌های معدنی بر تعداد و طول شاخساره و وزن تر و خشک اندام‌های هوایی در سطح احتمال یک درصد معنی‌دار است (جدول2). در مقایسه میانگین‌ها با آزمون دانکن در کلیه صفات بیشترین مقادیر آنها در نصف غلظت نمک‌های MS بدست آمد‌ (جدول3).

نتایج این آزمون با نتایج زیو (2000) مطابقت دارد (17) اما با نتایج حاصل از پژوهش‌های کاملوه و همکاران (1989)
 و گومارز و همکاران (1999) مغایرت دارد (6و8). براساس آزمایشات انجام شده توسط این افراد می‌توان گفت علی‌رقم نقش اساسی و موثر عناصر معدنی در فرآیند باززایی و پرآوری اسپروفیت سرخس بوستونی برای تقسیم و توسعه سلولی به غلظت کاهش یافته عناصر معدنی مخصوصاً نیتروژن در محیط کشت نیاز دارد (7) اما به نظر می‌رسد
MS 2/1 نه تنها اثرات بازدارندگی و سمیت عناصری چون نیتروژن را ندارد بلکه غلظت مناسبی از عناصر معدنی را برای تقسیم و تمایز سلولی فراهم می‌کند. جنبه دیگری از اثر غلظت عناصر معدنی بر پاسخ زیرنمونه‌ها که می‌توان آنرا بررسی نمود، اثر این عناصر بر ترکیبات هورمونی درونی است. گزارش شده است با افزایش نیتروژن تا یک حد اپتیمم، سیتوکنین درونی افزایش یافته اما با افزایش بیشتر نیتروژن مقدار سیتوکنین درونی کاهش می‌یابد (3). به طور مشابه شاید بتوان در مورد سرخس بوستونی نیز گفت که با افزایش غظت نمک‌های معدنی از MS 4/1 به MC 2/1 میزان سیتوکنین درونی که نقش شناخته شده در تولید شاخساره بیشتر دارد، افزایش می‌یابد. اما در غلظت کامل نمک‌های MS (در این تحقیق بررسی نشده است) افزایش مقدار نیتروژن از مقدار سیتوکنین درونی می‌کاهد. بنابراین چون تقسیم و توسعه سلولی در MS 2/1 بیشتر صورت می‌گیرد لذا انتظار می‌رود که بیشترین تعداد و طول شاخساره در این غلظت عناصر معدنی مشاهده شود و باالطبع بیشترین وزن تر و خشک اندام‌های هوایی نیز در همین تیمار حاصل شود.

اثر ساده غلظت ساکارز بر صفات اندازه‌گیری شده

اثر غلظت‌های ساکارز بر تعداد شاخساره، وزن تر و خشک اندام‌های هوایی تولید شده در مرحله پرآوری در سطح احتمال یک درصد معنی‌دار بود، اما بر طول شاخساره اثر معنی‌دار نداشت (جدول2). در غلظت 30 گرم در لیتر ساکارز به طور میانگین 5/13 شاخساره و 421/0 گرم وزن تر 091/0 گرم وزن خشک تولید شد که از غلظت 20 گرم در لیتر ساکارز با تولید میانگین 8/5 شاخساره با وزن تر 214/0 گرم و وزن خشک 066/0 گرم بیشتر بود (جدول4).

از آنجا که شاخساره‌های به کار رفته برای مرحله پرآوری، گیاهک‌های کوچک و جوان به طول 7ـ3 میلی‌متر بوده و حداکثر دارای 2 تا 4 برگ بودند. این شاخساره‌ها کاملا هتروتروف بوده و توانایی فتوسنتز ندارند از این جهت به قند (ساکارز) به کار رفته در محیط کشت جهت تقسیم و توسعه سلولی نیازمندند (15). احتمالاً میزان 30 گرم در لیتر ساکارز غلظت مناسب‌تری را از قند برای تقسیم سلولی فراهم می‌سازد. بنابراین در این تحقیق نیز در مطابقت با نتایج سایر محققین (8 و 17) غلظت بیشتر ساکارز (30 گرم در لیتر) باعث تولید شاخساره بیشتری شده است. به نظر می‌رسد بین اثر دو غلظت ساکارز به کار رفته در این آزمون از نظر نقش اسمزی و منبع کربن موثر بر طویل شدن شاخساره تفاوت کمی وجود دارد. به همین دلیل اثر ساکارز بر طویل شدن شاخساره نفرولپیس معنی‌دار نشده است. هر چند اثر غلظت‌های ساکارز بر افزایش طول شاخساره معنی‌دار نیست اما غلظت 30 گرم در لیتر ساکارز اثر مشخصی بر تعداد شاخساره‌های نابجا تولید شده است؛ که این خود دلیل بیشتر بودن وزن تر و خشک اندام‌های هوایی می‌باشد. نتایج بدست آمده از این تحقیق با نتایج سایر محققین مطابقت دارد (8 و 17).

اثرات ساده غلظت بنزیل آدنین بر صفات اندازه‌گیری شده

نتایج حاصل از جدول تجزیه واریانس (جدول2) نشان داد که اثر غلظت‌های مختلف BA بر کلیه صفات مورد اندازه‌گیری در سطح احتمال یک درصد معنی‌دار بود. در مقایسه میانگین‌ها مشاهد شد که با افزایش مقدار سیتوکنین از 5/0 تا 2 میلی‌گرم در لیتر تعداد شاخساره افزایش می‌یابد اما طول شاخساره و وزن تر و خشک اندام‌های هوایی کاهش می‌یابد (جدول5).

سیتوکنین‌ها عموماً در کشت درون شیشه‌ای باعث تورم بافت‌ها، القاء نمو جوانه‌های جانبی ضمن کاهش غالبیت انتهایی و نیز تولید جوانه‌های نابجا و شاخساره‌های جدید می‌شود (1، 2 و 3). اثرات سیتوکنین‌ها مخصوصاً BA نیز در تشکیل شاخساره‌ و تولید تعداد زیاد اسپروفیت در انواع مختلف سرخس‌ها گزارش شده است (4، 5، 6، 7 و 8). در این تحقیق نیز در تطابق با نتایج سایر محققین مشاهده می‌شود که با افزایش غلظت سیتوکنین تعداد شاخساره افزایش می‌یابد. یکی دیگر از اثرات بارز و شناخته شده غلظت‌های بالای سیتوکنین‌ها در محیط کشت کاهش طول شاخساره می‌باشد (6). معمولاً اکسین را مسئول اصلی افزایش طول سلول و در نتیجه افزایش طول بخش‌های هوایی گیاه می‌دانند اما در حقیقت تعادل هورمونی ایجاد شده در پاسخ سلول‌ها موثر است بطوریکه وقتی نسبت سیتوکنین به اکسین بیشتر باشد فرایند باززایی به سمت تولید شاخساره پیش می‌رود و در حالت عکس افزایش طول اندام‌ها و نیز تولید ریشه مشاهده می‌شود (1، 2 و 3). بنابراین بدیهی است که در غلظت‌های بالای BA (یک و دو میلی‌گرم در لیتر) طول شاخساره کمتر از غلظت 5/0 میلی‌گرم در لیتر BA باشد. در تیمارهای دارای غلظت 5/0 میلی‌گرم در لیتر BA ، میزان سیتوکنین به کار رفته در تعادل با اکسین درونی ریزنمونه در جهت افزایش طول سلول‌ها بوده و افزایش طول بیشتری را در سلول‌ها و در نتیجه شاخساره‌ها باعث شده است. از آنجا که عمده وزن سلول‌ها مربوط به سلولز موجود در دیواره‌های آنها و نیز آب است (1 و 2) بنابراین طبیعی است که وزن تر و نیز مقدار ماده خشک در غلظت 5/0 میلی‌گرم در لیتر BA که سلول‌ها در آن طویل شده و سلولز را بر دیواره‌های خود رسوب داده‌اند، بیشتر باشد. در غلظت‌های 1 و 2 میلی‌گرم در لیتر BA نیز تقسیم سلولی باعث افزایش تعداد سلول‌ها و وزن کلی ریزنمونه از طریق جذب آب و نه افزایش ماده خشک می‌شود. لذا نتایج بدست آمده با آنچه در سطح سلول‌ها اتفاق می‌افتد مطابقت دارد.

اثرات متقابل نمک‌های معدنی، ساکارز و بنزیل آدنین بر صفات اندازه‌گیری شده

اثرات متقابل غلظت‌های نمک‌های MS، ساکارز و هورمون BA بر کلیه صفات در سطح احتمال یک درصد معنی‌دار بود (جدول2). مقایسه میانگین‌های حاصل از آزمون دانکن نشان داد که از نظر تعداد شاخساره محیز کشت MS1 با تولید میانگین 8/24 شاخساره در گروه a و MS2 با 8/20 شاخساره در گروه b اما از نظر طول شاخساره به ترتیب با طول 7/4 و 7/5 در گروه‌های d و dc قرار گرفتند. محیط کشت‌های MS3 و MS6 بیشترین مقادیر طول شاخساره و وزن تر و خشک را به خود اختصاص داده‌اند (گروه a) ولی از نظر تعداد شاخساره به ترتیب در گروه‌های c و e قرار گرفته‌اند (جدول 6).

هیچ گزارشی در مورد بررسی اثر سه فاکتور فوق تواماً در ریزازدیادی سرخس بوستونی وجود ندارند. اما همانطوری که در مقایسه میانگین‌ها مشاهده می‌شود، بیشترین تعداد گیاهچه در نصف غلظت نمک‌های MS به همراه 30 گرم در لیتر ساکارز و یک یا 2 میلی‌گرم در لیتر BA تولید شده است. در این محیط‌ها غلظت بالای سیتوکنین باعث تشکیل اجسام سبز کروی شده است. با توجه به همبستگی تولید اجسام سبز کروی و تعداد گیاهچه تولید شده در همین مبحث تواماً به بررسی و بحث این دو صفت پرداخته می‌شود. همانطور که در جدول (7) مشاهده می‌شود، اجسام سبز کروی تنها در غلظت‌های یک و دو میلی‌گرم در لیتر BA تولید شده است (شکل 1). مطالعات میکروسکوپی اجسام سبز کروی نشان می‌دهد که آنها تجمعی از تعداد زیادی جوانه نابجا هستند (شکل2). جوانه‌های نابجای تولید شده بعد از گذشت 3 تا 4 هفته رشد کرده، توده‌ای از شاخساره‌های نابجا را تولید می‌کنند (شکل 3). جوانه‌های نابجا از طریق تمایززدایی[11] یاخته‌ای شکل می‌گیرند (1). از آنجایی که سیتوکنین‌ها دارای خاصیت تمایززدایی کم و بیش پیشرفته در یاخته هستند (3) و علاوه بر این شاید مهمترین نقش این تنظیم کننده‌های رشد در کشت‌های درون شیشه‌ای تحریک تقسیم و توسعه سلولی باشد (1 و 3) بنابراین می‌توان گفت که تولید اجسام سبز کروی در پاسخ به غلظت‌های بالای سیتوکنین‌ها صورت گرفته است. ولی چون تعداد زیاد شاخساره فقط در محیط‌های MS1 و MS2 تولید شده است، باید گفت اجسام کروی تشکیل شده تنها در حضور غلظت کافی نمک‌های معدنی (MS 2/1) و منبع غنی ساکارز (20 و 30 گرم در لیتر) تبدیل به شاخساره‌های نابجای زیادی می‌شوند. طویل‌ترین شاخساره‌ها در غلظت‌ نمک‌های  MS 2/1 و 5/0 میلی‌گرم در لیتر BA تولید شده‌اند که این نشان دهنده‌ تعادل هورمونی ایجاد شده سیتوکنین به کار رفته با اکسین درونی ریزنمونه هادر جهت افزایش طول سلول‌ها و در نتیجه شاخساره‌ها در حضور مقدار کافی عناصر معدنی (MS 2/1) است که غلظت ساکارز بر آن اثری ندارد. اما همانطوری که قبلا بیان شد، وزن تر و خشک در اندام‌ها و بافت‌های بالغ که دارای سلول‌های تمایزیافته هستند بیشتر از بافت‌های مریستمی است لذا در همین محیط‌ها بیشترین وزن تر و خشک مشاهده می‌شود.

به طور کلی می‌توان گفت بهترین محیط برای پرآوری باید شاخساره‌های فراوان و با اندازه کوچک تولید کند. لذا محیط کشت‌های MS1 و MS2 به ترتیب با تولید میانگین 8/24 شاخساره 6/4 میلیمتری و 8/20 شاخساره 7/5 میلی‌متری بالاترین میزان پرآوری (گروه‌های a و b) را به خود اختصاص داده‌اند. علاوه بر این اجسام سبز کروی که در واقع تجمعی از شاخساره‌های نابجا هستند در این محیط‌ها به تعداد زیاد مشاهده می‌شوند.

 

 

شکل 1- اجسام سبز کروی تولید شده در غلظت های بالای بنزیل آدنین

   

شکل 2- نمای میکروسکوپی برش طولی و عرضی اجسام سبز کروی

نقاط تیره‌تر نشانگر سلول‌های مریستمی در جوانه‌های نابجای تولید شده است.

 

شکل 3- شاخساره‌های حاصل از اجسام سبز کروی در محیط کشت های MS1 و MS2

 

(جدول 1) محیط های کشت به کار رفته در پرآوری ریزنمونه‌های شاخساره سرخس بوستونی

محیط کشت

تیمار

MS1

MS2

MS3

MS4

MS5

MS6

MS7

MS8

MS9

MS10

MS11

MS12

نمک‌معدنی MS

½

½

½

½

½

½

¼

¼

¼

¼

¼

¼

ساکارز g/l

30

30

30

30

30

30

20

20

20

20

20

20

بنزیل آدنین mg/l

2

1

5/0

2

1

5/0

2

1

5/0

2

1

5/0

 

 

(جدول 2) تجزیه واریانس تاثیر غلظت نمک‌های معدنی MS، ساکارز و بنزیل آدنین بر پاسخ ریزنمونه‌های شاخساره سرخس بوستونی در مرحله پرآوری

منابع تغییرات

درجه آزادی

میانگین مربعات صفات

تعداد شاخساره

طول شاخساره

وزن تر (گرم)

وزن خشک (گرم)

غلظت نمک های معدنی MS

1

25/506**

674/88**

496/0**

016/0**

غلظت ساکارز

1

622/537**

163/0ns

285/0**

006/0**

غلظت هورمون BA

2

322/100**

401/209**

159/0**

000/0*

اثر متقابل غلظت نمک های معدنی MS و ساکارز

1

033/208**

867/2 ns

072/0**

001/0**

اثرات متقابل ساکارز و غلظت هورمون BA

2

649/49**

/ 0 نظر / 23 بازدید